3.0 PEMUNGUTAN SPESIMEN
Untuk menentukan dan mengesan kehadiran helmint dan protozoa usus, kita memerlukan spesimen feses. Pemeriksaan feses secara makroskopik boleh dibuat dengan mata kasar dengan melihat sifat-sifat feses yang seperti berikut :
1. Bentuk
2. Keras
3. Cair
4. Saparuh keras
5. Berdarah merah
6. Berdarah merah hitam
7. Bermukus
Keputusan pemeriksaan berdasarkan kepada teknik pungutan spesimen feses yang baik dan cermat. Antara perkara-perkara yang perlu diawasi semasa memungut spesimen feses adalah seperti berikut :
1. Jumlah feses mencukupi iaitu jumlah minima yang diperlukan adalah
4 cm³. Ianya perlu bagi memudahkan kerja mengesan dan mengenal parasit serta mengelakkan kekeringan contoh feses yang terlalu cepat.
2. Berikan pesakit bekas yang sesuai iaitu bekas khas yang steril dan bertutup.
3. Apabila spesimen sampai di makmal, periksa dengan segera. Kelewatan mendiagnos spesimen akan menyukarkan proses mengenalpasti protozoa yang masih berada pada peringkat trofozoit.
4. Pastikan spesimen tidak bercampur dengan air kencing atau bahan yang boleh menganggu diagnosis spesimen.
3.1 Pengawetan spesimen feses
Proses pengawetan spesimen feses dilakukan supaya memastikan spesiman tahan lama untuk proses pemeriksaan yang lebih lanjut. Bahan-bahan pengawet yang sering digunakan untuk mengawet spesimen feses adalah seperti Formaldehid, larutan ‘Methiolie-Iodine-Formalin, dan Polyvinylalcohol (PVA)
4.0 PENDIAGNOSAN MAKMAL
Bagi melakukan perawatan, pengawalan dan pencegahan yang berkesan terhadap sesuatu infeksi parasit, diagnosis yang tepat mengenai parasit berkenaan perlulah dilakukan. Teknik makmal yang sesuai adalah penting untuk tujuan ini. Selain dari itu, pekerja terlatih dan sebuah makmal yang lengkap perlu ada untuk memastikan pendiagnosan berjalan dengan lancar.
4.1 Teknik Smear Direk
Prosedur :
1. Letakkan setitik bahan pencair Eosin, saline atau iodin.
2. Dengan menggunakan kayu applicator, letakkan sedikit spesimen feses ke atas slaid. Gaulkan feses dan bahan pencair tadi secara membulat. Ke
3. Kemudia, tutupkan dengan sisip kaca.
4. Periksa smear tadi dengan menggunakan kanta objektif mikroskop X10. Kemudian lihat smear di kanta X40 untuk mengenalpasti spesies protozoa atau helmint yang dilihat.
5. Buang smear ke dalam Lysol atau Germisept selepas pemeriksaan.
4.1.1 Fungsi bahan pencair
1. Saline
Sesuai digunakan ke atas spesimen feses cair yang mungkin mengandungi trofozoit protozoa yang kelihatan bergerak jika feses masih baru.
2. Iodin
Mewarnakan bahan-bahan dalam protozoa yang tidak terwarna oleh Eosin, seperti jisim glikogen.
3. Eosin
Mewarnakan bahan-bahan dalam feses dan memudahkan pengesanan parasit.
4.2 Teknik pemekatan
Teknik pemeriksaan ini dijalankan ke atas spesimen yang negatif dengan teknik smear direk atau bilangan parasit terlalu sedikit melalui teknik smear direk. Terdapat beberapa teknik yang digunakan, antaranya :
1. Pengapungan : Zink sulfat dan Brine
2. Pemendapan : Formalin-Ether dan pemendapan mudah
4.2.1 Teknik Zinc Sulphate Centrifugal Floation
Teknik ini adalah berdasarkan kepada prinsip penimbulan ova-ova helmint dan sista protozoa. Cara Zinc Sulphate ini sesuai sekali sebagai cara pemekatan untuk kebanyakan ova-ova cacing nematod. Ia juga sering kali digunakan dalam pemeriksaan rutin untuk sista-sista protozoa. Ova-ova dan cacing-cacing pita yang lebih besar dan berat adalah lebih sesuai dipekatkan oleh teknik-teknik pemendapan. Walaubagaimanapun, teknik Zink Sulphate adalah tidak sesuai untuk spesimen feses yang berlemak.
Prinsip : Menggunakan larutan yang mempunyai spesifik graviti yang lebih tinggi daripada spesifik graviti parasit menyebabkan parasit akan terapung.
Langkah-langkah :
1. Dengan menggunakan kayu applicator, pindahkan lebih kurang 1/3 ml contoh feses atau lebih jika najis didapati fibrous, ke dalam cawan kertas.
2. Ampaikan dengan kayu applicator dalam 1 ml air.
3. Sebuah tabung empar diisikan dengan penuh dengan air dan isipadu air dituangkan ke dalam cawan kertas yang mengandungi ampaian feses.
4. Ampaian feses disebatikan dan dituangkan kembali ke dalam tabung empar dengan bahan-bahan feses yang lebih kasar tertinggal di dalam cawan kertas. Cawan kertas tadi dibersihkan hingga bersih dan disimpan untuk langkah seterusnya.
5. Tabung empar di imbang dengan sebuah tabung empar yang lain. Seterusnya ianya diemparkan pada hadlaju tinggi dan supernatant dibuang.
6. 1 ml larutan ZnSO4 dipipetkan ke dalam tabung empar dan disebatikan.
7. Larutan ZnSO4 seterusnya ditambahkan hingga sampai ke bibir tabung empar.
8. Ampaian itu seterusnya di saring melalui lapisan gauze ke dalam cawan kertas dan tuangkan balik hasil saringan ke dalam tabung empar.
9. Tabung empar tadi seterusnya diemparkan kembali pada hadlaju tinggi.
10. Pipetkan setitik iodin ke atas sekeping slaid kaca. Ambil 1-2 loopful bahan terapung dengan loop dawai. Seterusnya sebatikannya bersama-sama dengan titisan iodin tadi dan tutupkannya dengan sekeping sisip kaca.
11. Slaid tadi kemudiannya diperiksa di bawah mikroskop menggunakan kanta objektif X10 dan X40.
4.2.2 Teknik Brine
Langkah-langkah :
1. Spesimen feses sebesar kacang diambil dan masukkan ke dalam cawan kertas yang mengandungi 4 ml larutan Brine tepu.
2. Larutan itu seterusnya disebatikan dengan cermat.
3. Sebatian itu seterusnya dituangkan ke dalam botol universal dan dengan perlahan-lahan larutan tepu brine ditambah sehingga separas dengan bibir botol.
4. Sekeping sisip kaca diletakkan di atas mulut botol supaya menyentuh permukaan cecair. Gelembung udara dipastikan tidak terbentuk. Biarkan selama setengah jam.
5. Sisipd kaca perlahan-lahan diangkat tanpa menjatuhkan larutan yang telah melekat padanya.
6. Iodin atau eosin diletakkan di atas sekeping slaid kaca, dan perlahan-lahan letakkan sisip kaca ke atas slaid yang mengandungi iodin atau eosin tadi.
7. Periksa di bawah mikroskop di bawah kanta objektif X10 dan X40.
4.3 Teknik pemendapan
Teknik pemendapan menggunakan medium pengampaian cair yang kurang berat daripada parasit supaya pemendakkan parasit boleh berlaku. Teknik ini berguna untuk memekatkan sista protozoa dan telur helmint.
4.3.1 Teknik pemendapan mudah
Kaedah pemendapan ringkas bagi diagnosis protozoa usus adalah rumit dan menghasilkan sedikit kepekatan sahaja. Sebaliknya, kaedah yang sama bagi diagnosis ova helmint mempunyai beberapa kelebihan daripada kaedah kepekatan lain kerana ova-ova daripada semua spesis ini akan mendap ke bawah. Kaedah ini digunakan terutama sekali bagi diagnosis ova ‘Schistosoma, Clonorchis dan Opisthorchis dan fluk heterofid. Walaupun teknik ini agak lambat, tetapi banyak bahan boleh diproses dengan hanya menggunakan sebuah bekas sahaja.
Langkah-langkah :
1. Sesudu besar spesimen feses diletakkan ke dalam penapis yang telah disediakan di atas sebuah flask air kencing.
2. Sebatikan spesimen feses dengan 50 ml air dengan menggunakan kayu applicator. Satu ampaian feses akan terdapat dalam flask air kencing.
3. Sebatikan spesimen feses dalam penapis wire di bawah arus air sehingga flask dipenuhi dengan ampaian.
4. Penapis wire dipindahkan dan ampaian dibiarkan mendap. Ianya mengambil masa 5 hingga 10 minit.
5. Supernatant dibuang dan seterusnya isikan dengan air, ampaian dibiarkan mendap sekali lagi. Ulang langkah ini sehingga supernatant menjadi bersih dan jernih.
6. Titiskan setitik mendapan ke atas sekeping slaind kaca yang bersih dengan menggunakan ‘pasteur pipitte’. Periksa slaid di bawah mikroskop.
4.3.2 Teknik Formalin-Ether
Teknik ini sesuai bagi pemekatan ova helmint dan sista protozoa dari spesimen feses dan juga apabila teknik Zinc sulphate didapati tidak sesuai untuk spesimen feses yang mengandungi banyak lemak dan asid-asid lemak. Ia juga digunakan ke atas spesiemn-spesimen feses yang telah diawetkan dalam formalin. Ova Trematoda dan ova-ova lain yang berat boleh dikesandengan teknik ini.
Langkah-langkah :
1. Kira-kira 1 ml spesimen feses di masukkan ke dalam tabung empar yang berisipadu 15 ml. Kemudian isikan sebanyak 3 ml air dan sebatikan.
2. Air ditambah sehingga penuh, disebatikan dan disaring dengan menggunakan gauze kedalam cawan kertas. Sekiranya isipadu filtrate didapati tidak mencukupi, air dituang lagi melalui gauze sehingga terdapat lebih kurang 15 ml filtrate.
3. Filtrate dituang ke dalam tabung empar yang telah dibasuh. Emparkan pada halaju 2000 rpm selama 1 minit.
4. Supernatant dibuang dan 10 ml 10% formalin dituang dan disebatikan. Lakukannya selama 10 minit bagi mengawet parasit.
5. Kemudian, masukkan 5 ml ether, tutup tabung empar dan goncang sekuat-kuatnya selama setengah minit. Empar pada had laju 1500 rpm selama 2 minit.
6. ‘Plug’ yang terbentuk dipindahkan dengan mencondongkan tabung tersebut sambil memastikan mendapan tidak terganggu.
7. Mendapan(sediment) ini seterusnya dititiskan di atas sekeping slaid kaca yang mengandungi setitik iodin. Sekeping sisip kaca seterusnya dilapiskan di atas slaid kaca tadi.
8. Periksa slaid di bawah mikroskop.
4.3 Pencelupan khas
Jika menjadi keperluan untuk membuat slaid bewarna dan pencelupan khas yang kekal bagi spesimen feses yang baru diperolehi bagi mengkaji protozoa usus, Bahan pengawet cecair seperti larutan Scauddin hendaklah digunakan. Beberapa jenis pewarna khas boleh digunakan seperti ferum-hematoksilin dan trichome.
Langkah-langkah :
1. Calitan diawet dalam larutan Schauddin selama 15 minit pada suhu bilik.
2. Calitan direndam dalam 70% alkohol selama 2-5 minit, kemudian direndam dalam larutan alkohol 70%+iodin, kemudian direndam ke dalam larutan alkohol 70% dan 50%.
3. Calitan dibasuh dengan air paip selama 2 hingga 10 minit.
4. Calitan seterusnya dicelup dalam larutan ferum-alum 2% selama 5 minit.
5. Basuh dengan air paip selama 5 minit. Warnakan dalam hematoksilin 0.5% selama 5 minit atau lebih. Seterusnya slaid dibasuh selama 5 minit.
6. SLaid tadi seterusnya di rendam dalam asid pikrik tepu selama 10 hingga 15 minit untuk memberikan perbezaan antara feses, parasit atau bendasing lain.
7. Slaid dibasuh dengan air paip selama 10 hingga 15 minit. Calitan dicelup dalam 70%, 80% dan 90% dan dua pertukaran alkohol mutlak.
8. Calitan seterusnya di rendam dalam xylene.
9. Calitan seterusnya di letak DEPEX dan sisip kaca diletakkan di atas slaid tadi. Biarkan slaid kering untuk beberapa ketika.
10. Periksa slaid di bawah mikroskop.
